选择丹磺酰氯作为衍生剂,其添加量优化结果见图1。生物色谱在丹磺酰氯添加量5~10mg/mL范围,高效随着添加量的液相增加,各生物胺的分析法峰面积增加;当丹磺酰氯添加量大于等于10mg/mL时,各生物胺峰面积不再随其添加量的白酒增加而增加,基本保持不变,和黄表明所衍生的酒中生物胺达到饱和状态。选取10mg/mL的生物色谱丹磺酰氯溶液作为本试验的衍生试剂。
比较ThermoHypersilGOLDC18柱(柱长250mm,柱内径4.6mm,分析法柱填料粒径5μm)与岛津InertsilODS-4C18柱(柱长150mm,白酒柱内径4.6mm,柱填料粒径5μm)对各生物胺的分离效果。经250mm色谱柱分离后,9种生物胺在37min内彼此分离且峰形对称。经150mm色谱柱分离后,37min内色谱图中只有8种生物胺的流出峰,无法在37min内分离9种生物胺。
流动相A与B的比例见表1。通过不断调整流动相A与B的含量,得到最优洗脱程序方案2。采用方案2对9种生物胺混标溶液进行洗脱分离,各生物胺流出峰彼此分离效果较好。
比较萃取处理对生物胺含量检测的影响。方案1直接对生物胺衍生,而方案2在对生物胺衍生之前进行萃取富集处理。选取尸胺、盐酸吡哆胺与β-苯乙胺3种生物胺,比较萃取处理对生物胺检测效果的影响,结果见表2。分析可知,对生物胺萃取处理后再衍生,生物胺损失程度减小,在样品复杂的基质中对生物胺的检测效果更佳,这说明对样品进行萃取、净化的重要性。
按照所建立的方法,将配制好的梯度系列标准溶液(50.00,25.00,5.00,1.00,0.50,0.25,0.20,0.10,0.05mg/L)进行线性试验。对标准溶液浓度(X)对其峰面积(Y)进行回归方程线性拟合,通过R2进行相关性评价。9种生物胺的检出限(LOD)与定量限(LOQ)通过3倍信噪比(S/N=3)与10倍信噪比(S/N=10)计算,结果见表3。优化的色谱条件程序洗脱后,混标中各生物胺色谱峰图如图1所示,各生物胺加标黄酒样品中的色谱峰图如图2所示。
由表3可知,9种生物胺在0.5~50mg/L质量浓度范围,该方法具有良好的线性关系,相关系数R2均大于0.998。检出限范围0.07~0.22mg/L,定量限范围0.07~0.73mg/L。分析图1与图2后发现37min洗脱与分离后,9种混合生物胺色谱峰先后流出,被成功分离。
选取3种生物胺做加标回收试验,向黄酒样品中加入3种浓度水平的混合标准溶液,加标量分别为1.0,5.0,10.0mg/L,其浓度均在线性范围。用所建立的方法进行前处理与测定,各加标水平样品平行测定3份,结果见表4。3种生物胺加标回收率在83.30%~114.70%之间,相对标准偏差(RSD)均低于4.56%,说明该方法对生物胺的检测结果较为准确,重复性好。
用所建立的方法分析黄酒与白酒中生物胺含量,结果见表5和表6。由表5可知,黄酒中含有8种生物胺,总含量为29.39mg/L,各生物胺含量均有差异。色胺与尸胺为该黄酒样品中的主要生物胺,含量分别为(18.06±0.012)mg/L与(4.28±0.059)mg/L,β-苯乙胺含量为(1.21±0.021)mg/L,腐胺含量为(2.15±0.002)mg/L,盐酸吡哆胺含量为(2.45±0.028)mg/L,组胺含量为(0.40±0.049)mg/L,酪胺含量为(0.75±0.003)mg/L,亚精胺含量为(0.09±0.003)mg/L,精胺未检出。白酒检测结果见表6。白酒中生物胺总含量在3.83~7.94mg/L之间,其中组胺在4种白酒中被检出,精胺只在一种白酒中检出,其余7种生物胺在5种白酒中均被检出。比较黄酒与白酒中各生物胺含量可以发现,黄酒中的生物胺总含量高于白酒。这与之前研究报道一致。虽然二者均采用酿造工艺,但是后期工艺不同,黄酒无需蒸馏处理,而白酒需蒸馏处理,蒸馏后酒体中生物胺含量大大减少。另外,催化氨基酸脱羧转变成生物胺的脱羧酶,在pH4.04~4.33的黄酒酿造过程中被诱导合成,导致黄酒中生物胺含量相对较多。
采用HPLC-紫外检测法,丹磺酰氯柱前衍生梯度分离洗脱黄酒与白酒中的生物胺,在37min内实现了两种酒体中9种生物胺的分离。比较分析黄酒与白酒中生物胺含量,结果该方法准确性好,可快速检测9种生物胺含量。
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